Im frühen 16. Jahrhundert definierte sich das Kloster Speinshart als ein Chorherrenstift, das dem Adel vorbehalten sei. In Folge kam es zur teilweisen Aufteilung des Klostervermögens unter den einzelnen Chorherren. Der gelehrte Abt Johann von Egloffstein erkannte jedoch die schlechte finanzielle Lage in Folge dieser Entscheidung und führte das Klostervermögen wieder zusammen. Vielleicht war es diese Zusammenführung, die einen Eintritt in das Kloster Speinshart für junge Adelige vollends uninteressant machte. Sein Nachfolger Abt Johann Gries beklagt nämlich den Nachwuchsmangel und sieht den Grund für die stagnierende Zahl der Konventmitglieder in der Reformation, die er als „eingefallene neue Sekte“ bezeichnete.
Sein Nachfolger schließlich, Abt Johann Georg von Gleißenthal, schloss sich dieser „neuen Sekte“, also der Lehre Luthers an. Nach Absprache mit dem Landesherrn heiratete er dann 1556 auch. Seine Abtswürde konnte er jedoch weiterhin behalten. Im gleichen Jahr verkündete Kurfürst Ottheinrich einen Erlass, nach dem das religiöse Leben in der Oberpfalz nach der lutherischen Lehre zu leben sei. Damit begann eine einschneidende Veränderung des klösterlichen Lebens in Speinshart. Eine Visitation Ende 1556 bestätigte das durchwegs protestantische Leben im Kloster, das der Abt mit seinen beiden Mitbrüdern führte. Der Konvent bestand also nur noch aus drei Personen. Schließlich zog der Abt, dem inzwischen ein staatlicher Verwalter an die Seite gestellt wurde, 1557 mit seiner Familie nach Amberg ins aufgehobene Franziskanerkloster.
Ein greifbares Datum dieser ersten Säkularisierung gibt es nicht. Es war mehr ein schleichender Prozess. Aber bereits 1556 kann man von einem säkularisierten, also einem verweltlichen Kloster sprechen – in zweifacher Hinsicht: Zum einen gab es innerhalb der Gemeinschaft kein katholisches, klösterliches Leben mehr und zum anderen wurde der Abt zu einer von der weltlichen Macht dirigierten Person. 1564 ging schließlich der gesamte Klosterbesitz in die staatliche Verwaltung über.